Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer de Salamanca

Stringent complete response (sCR) criteria are used in multiple myeloma as a deeper response category compared with CR, but prospective validation is lacking, it is not always clear how evaluation of clonality is performed, and is it not known what the relative clinical influence is of the serum free light chain ratio (sFLCr) and bone marrow (BM) clonality to define more sCR. To clarify this controversy, we focused on 94 patients that reached CR, of which 69 (73%) also fulfilled the sCR criteria. Patients with sCR displayed slightly longer time to progression (median, 62 vs 53 months, respectively; P = .31). On analyzing this contribution to the prognosis of sFLCr or clonality, it was found that the sFLCr does not identify patients in CR at distinct risk; by contrast, low-sensitive multiparametric flow cytometry (MFC) immunophenotyping (2 colors), which is equivalent to immunohistochemistry, identifies a small number of patients (5 cases) with high residual tumor burden and dismal outcome; nevertheless, using traditional 4-color MFC, persistent clonal BM disease was detectable in 36% of patients, who, compared with minimal residual disease-negative cases, had a significantly inferior outcome. These results show that the current definition of sCR should be revised.

The striking similarity displayed at the mechanistic level between tumorigenesis and the generation of induced pluripotent stem cells and the fact that genes and pathways relevant for embryonic development are reactivated during tumor progression highlights the link between pluripotency and cancer. Based on these observations, we tested whether it is possible to use a pluripotency-associated transcriptional reporter, whose activation is driven by the SRR2 enhancer from the Sox2 gene promoter (named S4+ reporter), to isolate cancer stem cells (CSCs) from breast cancer cell lines. The S4+ pluripotency transcriptional reporter allows the isolation of cells with enhanced tumorigenic potential and its activation was switched on and off in the cell lines studied, reflecting a plastic cellular process. Microarray analysis comparing the populations in which the reporter construct is active versus inactive showed that positive cells expressed higher mRNA levels of cytokines (IL-8, IL-6, TNF) and genes (such as ATF3, SNAI2, and KLF6) previously related with the CSC phenotype in breast cancer.

To improve the outcomes of patients with the otherwise incurable hematologic malignancy of multiple myeloma (MM), a key paradigm includes initial treatment to establish disease control rapidly followed by maintenance therapy to ensure durability of response with manageable toxicity. However, patients' prognosis worsens after relapse, and the disease burden and drug toxicities are generally more challenging with subsequent lines of therapy. It is therefore particularly important that patients with newly diagnosed multiple myeloma (NDMM) receive optimal frontline therapy. The combination of lenalidomide, bortezomib, and dexamethasone (RVd) has consistently demonstrated a tolerable safety profile with significant and clinically relevant benefit, including deep and durable responses with improved survival in patients with NDMM regardless of their transplant eligibility. Furthermore, comparative studies evaluating this triplet regimen against both doublet and other triplet regimens have established RVd as a standard of care in this setting based upon its remarkable and concordant efficacy. Given the breadth of clinical data, physician familiarity, inclusion in treatment guidelines, and the emerging potential of RVd-containing quadruplet regimens, RVd will likely continue as a key cornerstone of the treatment of NDMM, and its role will therefore likely continue to grow as a therapeutic backbone in the initial treatment of MM.

INTRODUCCIN 1 1. LA PROTENA Vav1 3 1.1. Estructura de la protena Vav1 5 1.2. Expresin tisular 6 1.3. Funcin biolgica 6 1.4. Regulacin de su actividad biolgica 8 1.4.1. Fosforilacin en tirosinas 8 1.4.2. Interacciones protena--protena 12 1.4.3. Localizacin subcelular 20 1.4.4. Otros mecanismos de regulacin postraduccional 20 1.4.5. Efectos de algunos medicamentos 20 1.4.6. Estados patolgicos 21 2. LA PROTENA Vav1 EN CLULAS HEMATOPOYTICAS 23 2.1. Anlisis gentico de la protena Vav1 23 2.1.1. Linfocitos T 23 2.1.2. Linfocitos B 31 2.1.3. Plaquetas 32 2.1.4. Neutrfilos 32 2.1.5. Macrfagos 32 2.1.6. Mastocitos 33 2.1.7. Clulas asesinas naturales (NK) 33 2.1.8. Clulas dendrticas 34 2.2. Vav1 como diana teraputica 34 OBJETIVOS 37 MATERIALES Y MTODOS 41 RESULTADOS 59 Captulo 1: Nuevo mecanismo

[ES] De acuerdo a lo reportado en el informe GLOBOCAN 2012 por la Agencia Internacional para Investigación en Cáncer (IARC), el cáncer de mama ocupó el primer lugar en incidencia y mortalidad por cáncer en mujeres, representado en cifras de 25.215 y 6.075 (casos por 100.000 habitantes) respectivamente (Ferlay, 2015). En el informe editado por la Sociedad Española de Oncología Médica la mayor incidencia, mortalidad y prevalencia a 5 años es para el cáncer de mama es de 29%, 15,5% y 40,8%, respectivamente (SEOM, 2014). Siendo así el tumor más frecuente en mujeres, tanto en España como en el resto del mundo, puesto que en Norte América la mortalidad anual es de 48.850 mujeres por año, con un número de nuevos casos anuales de más de 256.222 los cuales representan el 29.6% del total de cánceres en mujeres . Uno de los aspectos más importantes dentro de la problemática del cáncer de mama es la alta heterogeneidad que se pone de manifiesto no sólo en el grado de susceptibilidad a padecer el cáncer, así como en los distintos resultados clínicos marcados por la agresividad, respuesta al tratamiento y posibilidad de recaída. Existe un importante componente genético que va a controlar en cierta medida esta variabilidad, dicho componente viene determinado por la suma de efectos de múltiples genes de baja penetrancia, que interaccionan entre sí y con el ambiente (genes modificadores), siguiendo un modelo de herencia poligénica o cuantitativa (Balmain et al. 2003). Dentro de estos factores se destacan los microRNAs, quienes juegan un papel importante en procesos de desarrollo, crecimiento, metástasis y resistencia a medicamentos (Graveel et al., 2015), puesto que su desregulación influye en las vías de señalización celular, debido a su interacción a nivel pre- y post-transcipcional (Mulrane, et al., 2013). Existiendo una unión entre señales alteradas de miRNA y el desarrollo de cáncer de mama y metástasis, como es el caso de la perdida de los miRNA supresores tumorales (oncosupresores-miRs) let-7s, miR-34a/125s/200s ó por el contrario la sobreexpresión miRNA oncogénicos (oncomiRs) miR-21/135/155/224/373/520c entre otros (Tang, et al., 2012). Una vez diagnosticado el cáncer de mama, hay una serie de criterios establecidos para definir el pronóstico de las pacientes. Sin embargo, incluso en pacientes con el mismo subtipo de tumor, la respuesta de éste al tratamiento, tanto con la terapia habitual como con los inhibidores específicos de ERBB2 (Dean-Colomb and Esteva, 2008) es heterogénea: (i) tanto a corto plazo: incluido el grado de respuesta (completa, parcial y/o nula) (Smigal et al. 2006); (ii) como a largo plazo: incluida la recaída (con variable tiempo de latencia e “hibernación”), la resistencia tardía al tratamiento y el efecto sobre la progresión tardía a distancia o metástasis, causa última de la muerte de las pacientes. Parece que la diseminación tumoral y la respuesta al tratamiento tienen un importante control poligénico, cuya caracterización haría posible diseñar tratamientos más eficaces para el cáncer diseminado (Balmain et al. 2003, Winter et al. 2008). Siendo la recaída el problema de los pacientes que sí responden inicialmente, debido a que por criterios pronósticos deberían evolucionar bien, como sucede en un porcentaje de pacientes con tumor localizado y receptor de estrógenos positivo (ER+) que recaen (van de Vijver et al. 2002). El gran problema de la recaída es que, en muchas ocasiones, el tumor acaba por no responder a las líneas de tratamiento establecidas como antraciclinas y taxanos (resistencia “tardía”), incluso con los nuevos tratamientos como los inhibidores específicos de ERBB-2 Trastuzumab y Lapatinib (Slamon et al. 2001, Xia et al. 2006). Es preciso definir la causa como multifactorial, por la participación tanto del sistema inmune, la angiogénesis, apoptosis, etc. y, por tanto, poligénica (Aguirre-Ghiso 2007, Wahler J, 2015). En relación a esto, un importante número de miRNAs han sido relacionados con un incremento en la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos, debido a su interacción con proteínas envueltas en procesos de apoptosis o de supervivencia celular, tal es el caso de miR-128, 21, 200b/c, 451a relacionados con respuesta a Doxorrubicina, y miR-24, 125b a Docetaxel (Mulrane, et al., 2013). Por lo anterior es trascendental conocer los procesos y factores que determinan la resistencia al tratamiento (Cameron y Stein, 2008), así como los relacionados con la progresión de la enfermedad. La diferente progresión de tumores aparentemente similares y su respuesta al tratamiento está influenciada por un componente poligénico de genes modificadores (Balmain et al. 2003), y su caracterización permitirá una mejor evaluación pronostica de las pacientes, predecir su respuesta al tratamiento y tomar medidas más individualizadas. Finalmente, lograr dilucidar el componente poligénico de genes modificadores que determina la heterogeneidad en la evolución o comportamiento temprano y tardío del tratamiento, así como en susceptibilidad y progresión entre individuos que aparentemente poseen la misma enfermedad histopatológica, permitirá no sólo un mejor conocimiento de los mecanismos patogénicos de la enfermedad, sino también diseñar mejores estrategias de prevención, pronóstico y tratamiento. Hipótesis Uno de los aspectos más importantes dentro de la problemática del cáncer de mama es la alta heterogeneidad de su presentación clínica entre pacientes, considerándose una enfermedad de génesis compleja. Existen grandes diferencias en el grado de susceptibilidad a desarrollarlo y en la evolución de la enfermedad entre pacientes, en cuanto a la agresividad, respuesta al tratamiento y riesgo de recidiva, considerándose todos ellos fenotipos (en este caso, patofenotipos) complejos determinados por el efecto de genes encargados de regular diversos procesos en los diferentes niveles de la organización biológica. Una vez diagnosticado el cáncer de mama, hay una serie de criterios clínico-patológicos y moleculares establecidos para definir su pronóstico. Aún así, incluso en pacientes con el mismo subtipo de tumor y estadio de desarrollo tumoral, la respuesta al tratamiento es heterogénea (330). Ello se traduce en diferencias tanto en la respuesta inmediata al tratamiento como a largo plazo, incluidas la recaída, la resistencia tardía al tratamiento y el efecto sobre la metástasis, causa última de la muerte de las pacientes (331). Parece que la diferente evolución tumoral y la respuesta al tratamiento están influenciadas por un importante control poligénico y por múltiples determinantes moleculares (332, 333). Entre estos determinantes moleculares estarían los miRNAs, que son pequeñas moléculas de RNA que participan, fundamentalmente, en la degradación de mRNA específicos. De este modo, participan en la regulación de la expresión génica y tienen una función importante en procesos fisiológicos y patológicos, incluido el cáncer. Así, se describen diferentes miRNAs que participan en el desarrollo, crecimiento y capacidad de diseminación tumoral, así como en la resistencia a la quimioterapia (334). La desregulación de los niveles de miRNAs, influye en las vías de señalización celulares, debido a sus complejas interacciones a niveles pre- y post-transcripcionales (173). Se ha descrito la asociación entre señales alteradas de miRNAs y el desarrollo del cáncer, en general, y del cáncer de mama, en particular. Este sería el caso de la pérdida de miRNA supresores tumorales (oncosupresores-miRs) como let-7s, miR-34a, miR-125s y miR-200s, entre otros; así como de la sobreexpresión miRNA oncogénicos (onco-miRs), como miR-21, miR-135, miR-155, miR-224, miR-373 y miR-520c, entre otros (223) y con la respuesta al tratamiento (173). El distinto comportamiento del cáncer de mama entre pacientes que aparentemente tienen la misma enfermedad histopatológica y estadio evolutivo vendría determinado, en parte, por la suma de efectos de genes modificadores de baja penetrancia. Nuestra hipótesis de tra-bajo es que los miRNAs serían subfenotipos moleculares que contribuyen a la heterogeneidad de comportamiento tumoral. Por tanto, los genes que codifican los miRNAs podrían formar parte del componente poligénico que regula la diferente susceptibilidad y evolución del cáncer; y, en concreto, del cáncer de mama. Objetivos Objetivo global El objetivo global de este estudio es determinar si algunos miRNAs contribuyen a explicar la diferente susceptibilidad, evolución y respuesta al tratamiento del cáncer de mama y si los genes que los codifican pueden contribuir a la influencia poligénica de la enfermedad. Estudiar esta influencia en la población humana es difícil por la heterogeneidad genética de la población y la influencia ambiental compleja. Por ello, los estudios se llevan a cabo en un modelo de variabilidad fenotípica y genética limitadas y controladas. Este se generó mediante un cruce retrógrado o backcross entre dos cepas de ratón genéticamente homogéneas, singénicas, con distinto grado de susceptibilidad al cáncer de mama. Para responder a este objetivo global, planteamos los siguientes objetivos específicos: Objetivos específicos Objetivo 1. Evaluar si los niveles intratumorales de algunos miRNAs pueden contribuir a explicar la diferente susceptibilidad y evolución del cáncer de mama en ausencia de trata-miento. Objetivo 2. Determinar si los niveles intratumorales de algunos miRNAs contribuyen a explicar la variable respuesta al tratamiento del cáncer de mama con antraciclinas y taxanos, en condiciones de homogeneidad en los factores extrínsecos a la célula tumoral. Objetivo 3. Determinar si los niveles intratumorales de algunos miRNAs contribuyen a explicar la variable respuesta al tratamiento del cáncer de mama con antraciclinas y taxanos, en condiciones de heterogeneidad en los factores intrínsecos y extrínsecos a la célula tumoral. Objetivo 4. Validar in vitro el papel de algunos de los miRNAs estudiados